أخبار

IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) هو نظير من الركيزة β-galactosidase ، وهو شديد التحفيز.في ظل تحريض IPTG ، يمكن للمحفِّز تكوين معقد مع البروتين المكبِط ، بحيث يتم تغيير شكل البروتين المثبط ، بحيث لا يمكن دمجه مع الجين المستهدف ، ويتم التعبير عن الجين المستهدف بكفاءة.فكيف يجب تحديد تركيز IPTG أثناء التجربة؟هل الأكبر هو الأفضل؟
أولاً ، دعنا نفهم مبدأ تحريض IPTG: يحتوي عامل اللاكتوز للإشريكية القولونية (عنصر) على ثلاثة جينات هيكلية ، Z ، Y ، و A ، والتي تشفر β-galactosidase ، permease ، و acetyltransferase ، على التوالي.يحلل اللاكتوز اللاكتوز إلى جلوكوز وجلاكتوز ، أو في ألو لاكتوز ؛يسمح lacY للاكتوز في البيئة بالمرور عبر غشاء الخلية ويدخل الخلية ؛ينقل lacA مجموعة الأسيتيل من acetyl-CoA إلى β-galactoside ، والذي يتضمن إزالة التأثير السام.بالإضافة إلى ذلك ، هناك تسلسل تشغيل O ، تسلسل بدء P وجين تنظيمي I. كود الجين I هو بروتين مثبط يمكن أن يرتبط بالموضع O من تسلسل المشغل ، بحيث يتم قمع المشغل (meta) و أطفئ.يوجد أيضًا موقع ربط لموقع ربط بروتين CAP المنشط للجين التقويضي في بداية تسلسل البدء P. يشكل التسلسل P وتسلسل O وموقع ربط CAP معًا المنطقة التنظيمية لأوبون lac.يتم تنظيم جينات الترميز للأنزيمات الثلاثة من قبل نفس المنطقة التنظيمية لتحقيق التعبير المنسق للمنتجات الجينية.

في حالة عدم وجود اللاكتوز ، يكون أوبرون اللاكتوز (ميتا) في حالة قمع.في هذا الوقت ، يرتبط مثبط lac المعبر عنه بالتسلسل I تحت سيطرة تسلسل مروج PI بتسلسل O ، مما يمنع RNA polymerase من الارتباط بتسلسل P ويمنع بدء النسخ ؛عند وجود اللاكتوز ، يمكن إحداث أوبرون اللاكتوز (meta) في نظام الأوبرا (meta) هذا ، المحرض الحقيقي ليس اللاكتوز نفسه.يدخل اللاكتوز الخلية ويتم تحفيزه بواسطة β-galactosidase ليتم تحويله إلى allolactose.هذا الأخير ، كجزيء محفز ، يرتبط بالبروتين الكابت ويغير تكوين البروتين ، مما يؤدي إلى تفكك البروتين المثبط من تسلسل O والنسخ.يحتوي Isopropylthiogalactoside (IPTG) على نفس تأثير allolactose.إنه محفز قوي للغاية ، لا يتم استقلابه بواسطة البكتيريا وهو مستقر للغاية ، لذلك يستخدم على نطاق واسع في المختبرات.

كيفية تحديد التركيز الأمثل لـ IPTG؟خذ الإشريكية القولونية كمثال.
تم تلقيح سلالة E. coli BL21 المعدلة وراثيًا التي تحتوي على pGEX المؤتلف الإيجابي (CGRP / msCT) في وسط سائل LB يحتوي على 50 ميكروغرام · مل -1 أمبير ، وتم تربيتها طوال الليل عند 37 درجة مئوية.تم تلقيح الثقافة المذكورة أعلاه في 10 زجاجات سعة 50 مل من وسط سائل LB جديد يحتوي على 50 ميكروغرام · مل 1 أمبير بنسبة 1: 100 لثقافة التمدد ، وعندما كانت قيمة OD 0.6 ~ 0.8 ، تمت إضافة IPTG إلى التركيز النهائي.هو 0.1 ، 0.2 ، 0.3 ، 0.4 ، 0.5 ، 0.6 ، 0.7 ، 0.8 ، 0.9 ، 1.0mmol·L-1.بعد التحريض في نفس درجة الحرارة وفي نفس الوقت ، تم أخذ 1 مل من المحلول البكتيري منه ، وتم جمع الخلايا البكتيرية بالطرد المركزي وإخضاعها لـ SDS-PAGE لتحليل تأثير تراكيز IPTG المختلفة على تعبير البروتين ، ثم حدد تركيز IPTG مع أكبر تعبير بروتيني.
بعد التجارب ، سيتبين أن تركيز IPTG ليس كبيرًا بقدر الإمكان.هذا لأن IPTG له سمية معينة للبكتيريا.تجاوز التركيز سيقتل الخلية أيضًا ؛وبصفة عامة ، نأمل أن يكون البروتين الأكثر قابلية للذوبان المعبر عنه في الخلية أفضل ، ولكن في كثير من الحالات عندما يكون تركيز IPTG مرتفعًا جدًا ، سيتم تكوين كمية كبيرة من التضمين.الجسم ، ولكن كمية البروتين القابل للذوبان انخفضت.لذلك ، غالبًا ما لا يكون تركيز IPTG الأنسب هو الأفضل ، ولكن كلما كان التركيز أقل.
الغرض من استقراء وزراعة السلالات المعدلة وراثيًا هو زيادة إنتاجية البروتين المستهدف وتقليل التكاليف.لا يتأثر التعبير عن الجين المستهدف فقط بعوامل السلالة وتعبير البلازميد ، ولكن أيضًا بالظروف الخارجية الأخرى ، مثل تركيز المحفز ودرجة حرارة الاستقراء ووقت الاستقراء.لذلك ، بشكل عام ، قبل التعبير عن بروتين غير معروف وتنقيته ، من الأفضل دراسة وقت الحث ودرجة الحرارة وتركيز IPTG من أجل تحديد الظروف المناسبة والحصول على أفضل النتائج التجريبية.