منتجات

لتحديد كمية العديد من نواتج الأيض لـ 5-فلورويوراسيل (5-FU) واثنين من النيوكليوتيدات أحادية الفوسفات الذاتية ، قمنا بتطوير طريقة أصلية تعتمد على كروماتوجرافيا سائلة - قياس الطيف الكتلي الترادفي (LC-MS / MS).سمح هذا الاختبار بتحديد: (1) الإنتاج داخل الخلايا لـ 5-fluoro-2′-deoxyuridine-5′-monophosphate (5-FdUMP) من 5-FU أو 5-fluoro-2′-deoxyuridine (5-FdUrd) ، (2) تأثير تركيز 5-FdUMP على نسبة 2′-deoxyuridine-5′-monophosphate (dUMP) / thymidine-5′-monophosphate (TMP) ، و (iii) مدى إفراز 5-FdUMP و 5-FU من الخلايا البشرية المستزرعة بواسطة ناقلات ABC.في ظل ظروفنا التجريبية ، تم تحضين الخلايا بـ 5-FU أو 5-FUrd.بعد ذلك ، تم ترسيب البروتينات الخلوية بواسطة الميثانول.قدم هذا الإجراء انتعاش عالية الاستخراج.بالإضافة إلى ذلك ، لقياس إفراز 5-FU و 5-FdUMP من الخلايا ، قمنا بإجراء القياس الكمي لهذه الجزيئات في وسط الثقافة.تم حقن الوسائط إما مباشرة (5-FU) أو تم استخراجها بمرحلة صلبة باستخدام خرطوشة استخراج شمع الواحة (5-FdUMP).تم إجراء فصل المواد التحليلية على عمود dC18 Atlantis 3.5 ميكرون ، (100 مم × 2.1 مم id) مع وضع متساوي باستخدام محلول فورمات الأمونيوم / ميثانول / ماء (5/5/90 ، ت / ت) كمرحلة متنقلة.وقت التشغيل لم يتجاوز 6.2 دقيقة.تم تأين المواد التحليلية في واجهة رش كهربائي تحت وضع الأيونات السالبة.تحققنا من صحة الطريقة على مدى 2.5-150 نانوغرام مل -1 وفقًا للمركبات.كان التباين داخل وبين المقايسة أقل من 10 ٪ على مدى سبعة أيام.كانت جميع المركبات مستقرة في الخلايا أو في وسط المزرعة عندما تم تخزين العينات عند -20 درجة مئوية لمدة أسبوعين على الأقل ، وبعد ثلاث دورات تجميد-تذويب.لم يلاحظ أي تأثير مصفوفة في كلا الوسطين.